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本生資訊：考馬斯藍染料原理、使用步驟匯總
考馬斯藍染料簡介：
考馬斯藍廣泛用于瓊脂糖或丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質的可視化。
考馬斯亮藍R250(紅色染成藍色)電泳(更靈敏：可以檢測到0.1微克蛋白質)，考馬斯藍G250(淺綠色藍色)用于溶液中的蛋白質分析(方便-可溶)。兩者都可以用于每種應用中，但是它們可以互換使用，因為它們可以將蛋白質染色成不同的強度和顏色。
考馬斯藍染料技術說明：
考馬斯藍R-250和G-250染料是考馬斯染料的兩種最常見的化學形式，是二磺化的三苯基甲/烷化合物。R-250(紅色)缺少以G-250(綠色)形式存在的兩個甲基。“250"最初表示染料的純度。
考馬斯藍染色原理：
不同的顏色是染料分子不同帶電狀態(tài)的結果。
當pH值小于0時，考馬斯藍G250染料會腐蝕所有帶正電荷的三個氮原子，顏色為紅色最大吸收波長為465nm。當pH值約為1時，染料的總電荷為+1(2-磺酸基團帶負電，因為它們的pKa極低)，所以染料是綠色的，具有吸收能力最大值為620nm，而pH值高于2時，染料為亮藍色，最大值為595nm。在pH值為7時,二苯/胺部分帶正電荷，總電荷為?1，染料消光系數為43 000 M?1厘米?1.
染料與蛋白質的氨基和羧基(非共價)靜電相互作用，因此主要來自堿性氨基酸(主要是精氨酸、賴氨酸、組氨酸)，以及疏水性氨基酸(苯丙氨酸，酪氨酸、色氨酸)。當在pH=3.0的0.01M檸檬酸鹽緩沖液中溶解時，考馬斯的最大吸收波長為555nm;蛋白質-染料復合物的特征是峰略寬于游離染料的峰，最大值為549nm。
考馬斯凝膠染色劑和布拉德福德蛋白質分析試劑是以25-50%甲醇中的極酸性溶液配制的。在酸性條件下，染料主要通過堿性氨基酸(主要是精氨酸、賴氨酸和組氨酸)與蛋白質結合，而絡合物的形成穩(wěn)定了產生藍色的染料的負電荷陰離子形式。每個蛋白質分子結合的考馬斯染色配體的數量約為與蛋白質上發(fā)現的正電荷數成正比。蛋白質結合導致染料從紅棕色至亮藍色(最大吸收波長為595nm)。
考馬斯藍G-250染料的水溶性在膠體考馬斯染色方案中得到了很好的應用。
溶液中蛋白質測定-布拉德福德法
1. 著色溶液成分：5%考馬斯藍G250
2. 著色溶液制備：
a.將50mg考馬斯藍G250溶于50ml甲醇中
b.從步驟1開始向溶液中加入100ml 85%H3PO4
c.將步驟2的溶液加入500ml H2O中，混勻
d.過濾以去除任何沉淀物
e.再添加350ml H2O和miw 儲存于4°C。
3. 分析流程20-150 µg 蛋白; 200-1500 µg/mL
a. 準備0.15M NaCl溶液稀釋至最終濃度為250、，500、750和1500微克/毫升濃度。同時準備待測樣品稀釋液。
b. 向單獨的試管(或分光光度計試管)中添加100µL蛋白至以上濃度NaCl稀釋液中。
c. 再向每個試管中添加5.0mL考馬斯藍，通過渦流或倒置進行混合。
d. 將分光光度計調整到595nm的波長，并使用不含蛋白質的試管進行空白。
e. 等待5分鐘，在595nm波長下讀取每個標準和每個樣品。
f. 繪制標準溶液的吸光度與蛋白濃度的關系。計算消光系數并計算未知樣本的濃度。
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